В 1839 г. (в возрасте 14 лет) Уокер окончил университет Нэшвилла, где изучал юриспруденцию. Затем год изучал медицину в Эдинбургском и Гейдельбергском университетах. Несколько месяцев занимался врачебной деятельностью в Филадельфии, затем переехал в Новый Орлеан, где занимался журналистикой. В 1850 г. Уокер переехал в Калифорнию и устроился работать в газете сначала в Сан-Франциско, а затем в Мэрисвилле, где был ещё и практикующим адвокатом.
15 октября 1853 г. он отплыл из Сан-Франциско с отрядом наёмников для захвата мексиканской территории. Уокер высадился в Нижней Калифорнии и 18 января 1854 г. объявил её и соседний штат Сонора независимой республикой под своим управлением. Из-за начавшегося голода и нападений мексиканцев он вынужден был оставить это предприятие и вернуться к журналистике в Калифорнии.
4 мая 1855 г. Уокер с 56 последователями отправился в Никарагуа, где шла гражданская война и одна из враждующих партий обратилась к нему за помощью. В октябре Уокер захватил на озере Никарагуа пароход, принадлежащий американской транспортной компании, и благодаря этому смог захватить Гранаду, столицу противоборствующей партии. После окончания гражданской войны президентом Никарагуа стал Патрисио Ривас, хотя реальной властью обладал Уокер, использовавший президента как марионетку. 20 мая 1856 г. новое правительство Никарагуа было официально признано американским президентом Франклином Пирсом, который одобрил попытки «возродить» страну. В июне сам Уокер стал президентом Никарагуа, а 22 сентября с целью улучшить финансовое положение и заручиться поддержкой рабовладельческих штатов США отменил закон о запрете рабства.
Два представителя транспортной компании Корнелиуса Вандербильта решили с помощью Уокера завладеть имуществом компании в Никарагуа, предложив ему финансовую помощь и доставку новых рекрутов из США. Уокер помог в захвате компании, чем привёл Вандербильта в ярость, и он добился отмены признания американским правительством правящего в Никарагуа режима. При поддержке Вандербильта против Уокера начала войну коалиция государств Центральной Америки под руководством Коста-Рики. Уокер продержался до 1 мая 1857 г., после чего сдался американцам и был возвращён в США.
В следующие годы Уокер предпринимал несколько неудачных попыток вернуться в Центральную Америку, пока в августе 1860 г. не высадился в Гондурасе. Он захватил контроль над г. Трухильо, но был окружён гондурасскими войсками. Находясь в безвыходном положении, Уокер сдался британскому капитану Салмону, был передан властям Гондураса, осуждён и приговорён к смертной казни. 12 сентября 1860 г. он был расстрелян.